基金项目：赣州市卫生健康委员会市级科研计划项目（编号：2023-2-062）

结核病的预防和控制关键在于早期发现和及时治疗。在临床实践中，结核病的细菌学检查对于确诊和制定化疗方案至关重要^[1]。尽管涂片法操作简便、成本低廉，但存在一定的局限性，如不能区分活菌和死菌，且检测敏感性不足，难以满足临床诊断的高标准要求。传统的结核分枝杆菌分离培养方法虽然检测敏感性较高，但过程耗时较长，不利于快速诊断。BACTEC-960培养系统虽然检测速度快，但设备成本高昂，且依赖进口试剂，限制了其在临床上的广泛应用。近年来，分子生物学技术，如聚合酶链反应（PCR）和基因芯片技术等，在结核病诊断中的应用日益增多，但这些技术成本较高，技术操作复杂，难以在基层医疗机构中普及。

目前，结核分枝杆菌特异性抗原的自动化检测技术正逐渐受到医学界的关注^[2]。MPB64蛋白是结核杆菌复合群特有的标志物。我们对438例结核病患者进行了一系列的检测，包括痰涂片抗酸染色检测、改良酸性罗氏培养法、BACTEC-960液体培养法以及MPB64蛋白的免疫胶体金法检测，旨在比较这些不同检测方法的敏感性和准确性。此外，我们还利用结核分枝杆菌分泌的MPB64特异性蛋白^[3]，对结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌进行了鉴别，以提高诊断的准确性和可靠性。

对象和方法

一、对象：选取 2023年 1月 ～2024年 8月本院疑诊为肺结核住院患者438例。其中男性 269例,女性 169例,年龄在 17～82岁,平均 37∙5岁。

二、材料：抗酸染液和改良酸性罗氏培养基为本院实验室参照全国结核病细菌学检验规程自配,中国菌种保存中心提供的结核分枝杆菌标准菌株H37Rv作为质控参考株,960液体培养基及结核菌胶体金检测试剂盒均购自杭州创新生物检控技术有限公司,960液体培养基批号为 231215,230524；结核菌胶体金检测试剂盒批号230501,231104。

三、方法：（1）痰涂片抗酸染色检测：在治疗前收集痰标本,每个病例按规定查痰2次以上。具体操作步骤和判读标准参见《全国结核病细菌学检验规程 》^[4]。（2）传统培养法和液体培养基：将痰标本4%  NAOH处理后,吸取 0∙1 ml均匀地接种于改良酸性罗氏培养基斜面；碱处理后再行中和离心 接种于960液体培养基中,放入 37℃孵箱中进行培养,并且每隔 5天观察一次生长情况,肉眼观察培养基底层有颗粒状沉淀或浑浊时,涂片染色检查见抗酸杆菌后,方可报告分枝杆菌培养阳性。（3）MPB64免疫胶体金法：经 960液体培养基培养后（10～15天 ）,吸取 200μl 960液体培养上清液加入结核菌胶体金检测试剂盒的检测孔中,15min后观察结果,结果判定：检测区和控制区均出现紫红色条带为阳性结果,在控制区出现紫红色条带,在检测区未出现为阴性结果。控制区未出现任何条带需重新检测。

结果

一、960液体培养法与结核菌胶体金法检测结核分枝杆菌所需时间比较：从 438例患者中选取33例痰涂片确认为阳性的标本做检出时间对比试验,33例结核分枝杆菌检测结果  见表 1。液体960培养法 +MPB64胶体金检测试剂盒检出所需时间为 5～20天,平均为 10∙83天；而液体960培养法检测需时间为 20～30天,平均为 20∙45天。在第15天时,960液体培养法 +MPB64胶体金检测试剂盒可以检测到 32例结核分枝杆菌,而960液体培养法仅检测到11例结核分枝杆菌, 并且有1例在第30天时仍未检测到。

表 1 12例结核病例液体960培养法与 MPB64 胶体金试剂盒检出结核分枝杆菌时间比较

二、比较痰涂片抗酸染色、改良酸性罗氏培养、960液体培养及MPB64的免疫胶体金法检出率：以上四种方法对结核分枝杆菌的检测结果见表 2和表 3。

表 2 四种方法对结核分枝杆菌检测结果

表 3 四种不同方法检测结果

表 3中,有6例960液体培养 +MPB64的免疫胶体金法检测为阴性,而抗酸染色和罗氏培养两种方法检测为阳性,培养菌株经生化分型鉴定为非结核分枝杆菌,其中5例龟分枝杆菌,1例结核分枝杆菌。基于MPB64的免疫胶体金法 针对的是结核分枝杆菌,对于其他非结核分枝杆菌是阴性反应。 960液体培养 + MPB64的免疫胶体金法检测结核分枝杆菌的特异性为98∙4％。

讨论

结核病是严重危害人类健康和生命安全的慢性传染病, 多年来,痰涂片抗酸染色检查一直作为肺结核诊断的金标准广泛应 用 于 临 床。但该 方法敏 感 性 较 低,通 常 需 5000~  10000条菌 /ml才能得到阳性结果,无法辨别死菌与活菌。痰  涂片抗酸染色检测的阳性率和标本的质量有关,来自肺深部的干酪痰、血痰等合格标本的检出率比较高；另外结核菌的排 出不是连续性的,而是间隔性的,不能采集患者的全程标本, 也成为检测率不高的一个原因。改良罗氏培养缺点是需时太长,提出 4～8周才能获得结果,不能满足临床诊治的需求。常规免疫学诊断方法特异性低,分子生物学诊断方法需特殊仪器,技术要求极高。 因此,发展特异性强、敏感度高、快速、 简便、经济的结核病细菌学检查方法是大家共同期盼的。目前结核分枝杆菌特异性抗原的自动化检测技术越来越受到重视。 MPB64蛋白抗原为结核菌菌群包括人结核菌、牛结核菌和非洲结核菌中特异性的分泌蛋白质,它是在牛结核菌弱毒株 BCG 中的培养液中首次分离的,而在非结核分枝杆菌中不形成 MPB64^[5]。 MPB64是结核菌群培养中分泌到菌体外的分子量为24kD a的蛋白质,生长过程中能够分泌到菌体外,易被检出。其单克隆抗体结合免疫金标技术已应用到结核菌复合群的快速检测^[6]。 由于机体受到结核分枝杆菌感染后,体内首先出现的是结核抗原,而结核抗体则要感染后8周起逐渐产生,因此检测结核抗原具有早期诊断价值。检测结核抗原、直接反映感染的存在^[7]。 MPB64不仅可以作为结核菌快速诊断的靶标,而且可以作为快速区分结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌的靶标^[8]。在本次试验中,痰涂片抗酸染色检测阳性率仅为 14∙6％ 。 罗氏培养基检测结核菌阳性率为 20∙1％；960液体培养法阳性率为24∙3% ;MPB64金  标法阳性率为 24∙7％ ,比痰涂片和罗氏培养基检测分枝杆菌  结果高。从表 1中可以看出,在培养的第 5天,MPB64就可以被结核菌胶体金检测试剂盒检测到,并且在第 15天已经检测到 32例；而液体960培养法涂片检查未能检测到结核杆菌, 在第 30天时仍有1例检测为阴性。可能是由于此例结核分枝杆菌在 960液体培养基中生长缓慢。在检出率比较试验中有 5例痰结核菌检查和传统培养法检测结核杆菌阳性,而MPB64检测为阴性,这5例结核杆菌经鉴定是不能被 MPB64 单克隆抗体检出的其他非结核分枝杆菌。可见,痰结核菌检查和传统培养法不能有效地区分结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌,其误报常导致抗结核治疗的失败^[9]。因此培养法结合基于MPB64的免疫色谱法对分枝杆菌 的鉴定和区分非结核分枝杆菌具有快速、省时、经济、操作方 便、无须大型仪器投入的优点,有望在结核病的诊断中得以应用,是对现有结核病细菌学检查手段的有益补充。并将这种特异性强、敏感度高、快速、简便、经济的结核病细菌学检查方 法向基层医院推广,能极大地提高结核病早期诊断水平,减少过诊率和误诊率,满足患者越来越高的要求。另外,该方法是在安全柜内向样本滴下待测的样本就能进行检查,所以与别 的方法比较,菌体向周围飞散可以控制在最小程度,对减轻医务工作者在工作期间的感染机会非常有效。

参考文献：

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[9] 易俊莉,杨新宇,张洁,等.三种检测技术鉴别结核分枝杆菌复合群与非结核分枝杆菌的效能评价[J].结核病与肺部健康杂志, 2020, 001(004):240-244.DOI:10.3969/j.issn.2096-8493.2020.03.007.