新型冠状病毒（2019-nCoV）属于冠状病毒科，会导致宿主发生呼吸道、肠道、脑、尿道等多种组织及系统疾病^[1]。由于2019-nCoV最严重的症状多见于肺部及呼吸道，而将其所引发的疾病，也被称之为新型冠状病毒肺炎（COVID-19）。由于其具有高传播性，从流行病学出发，及早确诊是有效隔离感染源的必要措施^[2]。对于临床诊断，实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和病毒基因测序被认为是2019-nCoV核酸检测的金标准。但RT-PCR及病毒基因测序会受到临床所采集的样本病毒载量的限制，会对结果造成影响。临床上多以上呼吸道标本、口咽拭子和鼻咽部拭子为主^[3]，对于大便拭子的采集较少，本研究旨在确定大便拭子用于2019-nCoV核酸检测的诊断价值。

1 资料与方法

1.1一般资料  本研究以2020年1月24日至2020年2月24日我院收治的7例疑似并最终确诊为COVID-19患者为研究对象，COVID-19的诊断标准为《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案（第四版）》^[4]，其中1号病例为普通型，成年男性；2号病例为普通型，成年女性；3号病例为无症状感染者，成年女性；4号病例为普通型，成年男性；5号病例为普通型，孕妇；6、7号病例均为普通型，儿童病例。

1.2标本采集

由培训后的专职护士在三级防护的条件下，于患者确诊第1、3、5、7、9、11、13、18、21、24、24d，分别采集患者的鼻咽拭子和大便拭子，标本放置于大小适中的带外螺旋盖子、有垫圈的耐冷冻的标本收集器内，拧紧并迅速密封送检，并在60min内送检并进行检测。

1.3 RNA 提取 采用QIAamp viral RNA mini kit试剂盒，分别自标本收集器中获得50μL的总RNA溶液，得到实验所需提取的RNA并保存，保存温度在-20℃待用。

1.4检测方法  

首先进行基因GAPDH的检测，采用One-step RT-PCR Kit 反应试剂盒及相应的引物探针[GAPDH-F: 5'-CACATGGCCTCCAAGGAGTAA-3', GAPDH-R: 5'-TGAGGGTCTCTCTCTTCCTCTTGT-3' GAPDH-Prob: 5'-（FAM）CTGGACCACCAGCCCCAGCAAG（BHQ1）-3']，经人体细胞管家基因GAPDH检测。反应程序设定在：45℃10min，95℃10min，95℃15s，60℃1min，40个循环。RNA倍增结束后，置于ABI 7500仪器上进行测定，荧光检测通道选取FAM/none，将单点荧光检测设定在60℃，参考选择ROX。然后对病毒基因ORF 1ab及N基因加以测定，反应试剂盒及引物探针与基因GAPDH保持一致，反应程序为45 ℃10 min, 95 ℃10 min; 95 ℃15 s, 55 ℃1 min, 40 个循环。循环结束置于ABI 7500 荧光定量 PCR 仪上，将单点荧光检测设定在55℃，荧光检测通道选择 FAM/none，被动引用选择 ROX。

1.5 判定标准 阳性（Ct 值≤37，典型扩增曲线），灰区（37＞Ct 值≤40），阴性（Ct 值＞40 或无，无扩增曲线）^[5]。

1.6结果判读  基因GAPDH和/或N基因为阳性视为2019-nCoV阳性；基因GAPDH且N基因均为阴性视为2019-nCoV阴性。

1.7观察指标

采集患者的阳性持续时间（核酸阳性检出至最后1次阳性时间）、转阴时间（末次核酸测定阳性时间）。

1.8统计方法  数据采用均数±标准差表示，应用t检验，以P＜0.05存在统计学意义。

2.结果

2.1 7例患者鼻咽拭子及大便拭子核酸结果对比 （见表1）

表1  7例患者鼻咽拭子及大便拭子核酸结果对比

注：A样本为咽拭子，B样本为便拭子。

2.2 咽拭子及便拭子的结果对比 大便拭子的阳性持续时间、转阴时间均显著高于咽拭子（P＜0.05），咽拭子及便拭子的存在的差距时间为（12.86±4.52）d。（见表2）。

表2 患者咽拭子及便拭子阳性情况结果比较

3. 讨论

2019-nCoV病毒被认为是引发我国武汉地区乃至全世界范围内的2019年新型冠状病毒肺炎（COVID-19）的病原体，被归属于冠状病毒科β 属^[6]。由于其基因特征与非典型肺炎（severe acute respiratory syndrome，SARS）相关的冠状病毒及中东呼吸系统综合征冠状病毒（Respiratory syndrome coronavirus in the Middle East，MERS）存在显著差异。石正丽等研究证实，2019-nCoV与蝙蝠SARS样冠状病毒（bat-SL-CoVZC45）同源性高达85%以上。体外培养，96h后就可以在人体呼吸道上皮细胞上发现2019-nCoV病原体，与SARS对肺上皮细胞的影响相似^[7]。因此，多数学者认为，2019-nCoV与SARS存在更多的相似性。

但从临床收治情况来看，多数患者属于轻症、普通型，少数患者发展为重症，老年及存在高血压、糖尿病等免疫功能下降者预后较差，且人群普遍易感。而SARS多在感染发展为重症后才具有传染性，从传播开始时间看，与SARS存在明显不同^[7]。第六版新型冠状病毒共识指出：呼吸道飞沫、气溶胶、密切接触均属于其传播途径。从临床首发症状方面看，体温异常、呼吸困难、腹泻、乏力、结膜炎均属于主要症状。从本研究结果中证实，7例患者均可以从大便样本中检测出核酸阳性，这就不得不重视粪口途径传播的可能。但从冠状病毒属病毒的特点分析，通过粪口途径传播的可能性较小。不过，从冠状病毒的起源来讲，其与轮状病毒具有一定的相似性及共线性^[8]，也有学者将冠状病毒称之为轮冠状病毒。但轮状病毒多感染少年儿童，但近些年，成年人感染高致病性轮状病毒患者有所增加。而且，COVID-19被认为具有自限性，即多数患者可通过自身免疫功能来达到康复的效果，从这一点上看，与轮状病毒特点更为相似。

本研究发现，大便拭子的阳性持续时间、转阴时间均显著高于咽拭子（P＜0.05），咽拭子及便拭子的存在的差距时间为（12.86±4.52）d。由于RT-PCR及病毒基因测序所测定的标本阳性，就代表患者样本体内一定存在病毒，而鼻咽部拭子可能病毒载量低，难以测试需求。但大便拭子病毒核酸检测阳性时间持续更久。出现这个结果可以从两方面考虑，一方面，肠道内属于被灭活的死病毒，肠道属于代谢及灭活的主要途径，另一方面，肠道是被忽视的病毒致病的原发灶之一，国家第七版诊疗规范提示，食管、胃和肠管黏膜上皮不同程度变性、坏死、脱落，这也提示病毒在上皮细胞存在增殖情况，人体经过治疗后肺脏的病毒载量下降，肠道随之减少，不过当患者诊疗终止或可在肠道内继续增殖。但从多数对临床上复阳病例的观察发现，患者并未对其他接触人员造成感染^[9]。考虑这可能是受到该疾病传播特点多集中于发病早期有关。

同时，患者粪便核酸监测阳性持续时间较长，而呼吸道鼻咽试子持续时间相对较短，不排除病毒在肠道上皮细胞内繁殖扩增的可能，这也证实了该病毒不单纯是一种呼吸道病毒，而且有可能是一种肠道系统病毒。这就对该疾病的防控和治疗提出了新的要求。而且患者可以在鼻咽试子呈阴性的情况下大便核酸监测仍呈阳性且阳性率较高，而且持续较长时间，提示粪便标本可以作为溯源追踪的依据。而且两例儿童患者的大便阳性，且无症状并且鼻咽试子和大便持续阳性，作为健康携带者成为传染源的意义更大。加强对有流行病学资料而无症状的儿童进行病毒监测^[9]，控制其作为传染源。因此，在临床诊疗过程中，不应局限于鼻咽部拭子转阴，应对肠道内病毒阳性加强关注。另外，笔者参照新型冠状病毒肺炎诊疗方案（第六版）中医治疗方案推测，COVID-19首先感染的途径为口鼻，随吞咽动作入胃肠道，在胰腺或十二指肠出现增殖，继而侵袭肠道上皮细胞，并在肠道上皮细胞内持续增殖，长期存在，或被当做营养物质吸收入血而并进入血液或淋巴系统，然后随血液或淋巴循环，造成T淋巴细胞水平下降，并随血液或淋巴扩散至心、肺、肝、脑、肾等重要脏器，引发重症感染。未来有必要对疑似病例采用大便拭子筛查，确定便拭子及咽拭子对疾病早期诊断的临床价值，并以粪便核酸转阴作为解除隔离的指证，以避免消化道传播。同时对于隔离以避免下水道造成气溶胶传播的可能提出了更高的要求。

     综上所述，新型冠状病毒肺炎患者的大便拭子阳性出现转阴更晚，用鼻咽部拭子和大便拭子进行筛查，结果会产生显著差异，与鼻咽部拭子标本相比，大便拭子更具临床诊断价值，同时可对该病的传播方式及隔离提出进一步的探索要求。

参考文献：

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[3陈莉莉,赵国元.试从“肺与大肠相表里”理论认识新型冠状病毒肺炎[J].实用中医内科杂志,2020,4(16):4

[4黄春明,李踔,吕明芳,等.诱导痰查出咽拭子5次假阴性新型冠状病毒肺炎1例[J].广东医学,2020,(8):805-807

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[6]刘焱斌,刘涛,崔跃,等.鼻拭子与咽拭子两种取样方法在新型冠状病毒肺炎核酸筛检中的比较研究[J].中国呼吸与危重监护杂志,2020,19(2):141-143.

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[8]中华人民共和国国家卫生健康委员会.新型冠状病毒肺炎诊疗方案（试行第四版）[J].天津中医药,2020,37(3):242-246.

[9]郑相淮,林曦.新冠肺炎疫情期间咽拭子取样方法改进[J].实用口腔医学杂志,2020，(2):264-265.